PERSIAPAN MEDIA , LARUTAN PENGENCER, dan KERJA ASEPTIK
Media adalah suatu substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang disesuaikan dengan lingkungan hidupnya. Media kultur berdasarkan konsistensinya dibedakan atas tiga macam, yaitu:
- Media cair (liquid medium) adalah medium berbentuk cair yang dapat digunakan untuk tujuan menumbuhkan atau membiakan mikroba, penelaah fermentasi, uji-uji lain. Contohnya : Nutrient Broth (NB), Lactose Broth (LB) dan kaldu sapi.
- Media semi padat (semi solid medium), biasanya digunakan untuk uji mortalitas (pergerakan) mikroorganisme dan kemampuan fermentasi. Contohnya : Agar dengan konsentrasi rendah 0,5%.
- Media padat (solid medium) adalah medium yang berbentuk padat yang dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba dipermukaan sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung dan diisolasi. Contohnya: Nutrient Agar (NA), Plate Count Agar (PCA), Potato Dextrose Agar (PDA), gelatin, silika gel dan beberapa limbah pertanian berbentuk padat (Ardiansyah 2004).
Media berdasarkan fungsinya, yaitu:
- Media diperkaya (enriched medium) adalah medium yang ditambah zat-zat tertentu (serum, darah, ekstrak tumbuhan dan lain-lain), digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof.
- Media selektif (selective medium) adalah media yang ditambah zat kimia tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain sehingga dapat mengisolasi mikroba tertentu, misalnya media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu, dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi bakteri gram negatif. Contohnya : Endo Agar, EMB(Eosin Metilena Biru) Agar, SSA (Salmonella Shygella Agar), VRB (Violet Red Bile Agar)
- Media diferensial (deferential medium) adalah media yang ditambahkan zat kimia tertentu yang menyebabkan mikroba membentuk pertumbuham atau mengadakan perubahan tertentu hingga dapat membedakan tipenya. Contohnya : TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
- Media penguji (assay medium) adalah media dengan susunan tertentu digunakan untuk pengujian-pengujian vitamin, asam amino, antibiotik dan lain-lain.
- Media untuk perhitungan jumlah adalah media spesifik yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroba. Contohnya : Plate Count agar (PCA).
Komposisi medium
Untuk menstimulir pertumbuhan mikroba, media harus memiliki komponen-komponen yang di butuhkan mikroba seperti air, karbon, energi, nitrogen, mineral dan faktor pertumbuhan lain seperti vitamin dan asam amino. Mikroba juga mempunya pH maksimum dan optimum untuk pertumbuhannya, oleh karena itu dalam persiapan media perlu dilakukan pengaturn pH sehingga tercapai pH optimum untuk pertumbuhan mikroba yang diinginkan (Mulyana 1992).
Pembuatan media dapat dilakukan dengan menimbang bahan kimia secara teliti, kemudian mencampurkanya/melarutkannya dalam air suling ,mengatur pHnya, dan memasukan ke dalam tabung, serta mensterilkannya menggunakan otoklaf pada suhu dan waktu yang ditetapkan misalnya suhu 121 derajat (tekanan 151b) selama 15-20 menit(Mulyana 1992). Medium padat mengandung bahan pemadat seperti agar ,gelatin, atau silika gel. Agar paling sering digunakan yang merupakan bahan dari peganggang laut. Media yang mengandung agar akan mencair dalam suhu 79-100 derajat dan setelah sterilisasi media, agar akan membeku dalam suhu 42 derajat. Media yang disimpan dalam memadat, misalnya dilemari es dapat dicairkan kembali dengan memanaskan wadah menggunakan pemanas. Media yang akan di inokulasi dengan mikroba tentu sebelum memadat harus didinginkan terlebih dahulu disuhu ruangan sampai 47-50oC. Jika media terlalu panas, mikroba yang akan ditumbuhkan akan mati( Yanny 2004). Struktur kimia agar terdiri dari galaktan, yaitu polimer dari molekul-molekul galaktosa yang tidak dapat dipecah kebanyakan oleh mikroba. Konsenterasi yang digunakan biasanya 1,5% ,tetapi jika akan dilakukan goresan pada permukaan agar dapat digunakan konsentrasi 1,8-20% sehingga dapat agar yang lebih keras setelah memadat. Media setengah padat mengandung agar yang jumlahnya sedikit dari pada media padat biasanya sekitar 0,5% dan sering digunakan uji pengerak mikroba (motilities). Dialer media agar tidak terdapat bahan makanan untuk mikroba ,melainkan hanya sebagai bahan pemadat( Yanny 2004).
Bentuk dan jumlah media
Jumlah media yang akan digunakan di dalam suatu percobaan harus diperhitungkan sedemikian rupa untuk menghindari pembuatan media yang berlebihan karena mahal harganya.jumlah media yang digunakan dapat ditentukan berdasarkan bentuk meda yang di gunakan dan jumlah pekerjaan contoh sbb:
- Agar cawan :15-20ml/cawan petri
- Agar tegak :8-9ml/tabung reaksi
- Agar miring :6-7ml/tabung reaksi
- Media cair :9-10ml/tabung reaksi
- Media cair berisi tabung durham :9ml/tabung reaksi
Persiapan dan pembuatan media
- Pembuatan Media PDA
- Ditimbang 4.9 gram PDA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100ml.
- Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan.
- Dipanaskan di hot plate sambil diaduk hingga larutan mendidih.
- Ditutup dengan alumunium foil.
- Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 800oC selama 20 menit.
- Pembuatan Media PCA
- Ditimbang 2.35 gram PCA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100ml.
- Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan.
- Dipanaskan di hot plate sambil diaduk hingga larutan mendidih.
- Ditutup dengan alumunium foil.
- Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 800oC selama 20 menit.
- Pembuatan Media NA
- Ditimbang 2.3 gram NA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100ml.
- Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan.
- Dipanaskan di hot plate sambil diaduk hingga larutan mendidih.
- Ditutup dengan alumunium foil.
- Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 800oC selama 20 menit.
- Pembuatan Media NB
- Ditimbang 0.8 gram PDA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100ml.
- Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan
- Dipanaskan di hot plate sambil diaduk hingga larutan mendidih.
- Ditutup dengan alumunium foil.
- Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 800oC selama 20 menit.
Larutan Pengencer
Larutan pengencer/ larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan kepadatan bakteri yang ditanam (Fais, 2009). Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan sehingga volume larutan menjadi berubah (Nurohaianah et al, 2007).
Seperti halnya media, larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh biasanya mangandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba. Buffer yang digunakan untuk pembuatan media dan larutan pengencer adalah fosfat. Pengunaan fosfat dikarenakan satu-satunya komponen anorganik yang mengandung sifat buffer pada kisaran pH normal, yaitu merupakan pH yang dapat mempertahankan keseimbangan fisiologi dari mikroba. Selain dari itu fosfat tidak mempunyai unsur racun bagi mikroba. Garam fosfat yang sering digunakan sebagai buffer adalah kalium monohidrogen fosfat atau kalium hidrogen fosfat. Sebagai larutan pengencer, selain larutan yang mengandung buffer fosfat, dapat juga digunakan larutan garam fisiologi (0,85%) atau larutan reagen. Larutan pengencer ditempatkan dalam tabung reaksi adalah 9 ml setiap tabung nya.
- Pembuatan Larutan Fisiologis
- Ditimbang 0.8 gram NaCl dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100ml.
- Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan
- Dipanaskan di hot plate sambil diaduk hingga larutan mendidih.
- Ditutup dengan alumunium foil.
- Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 800oC selama 20 menit.
Kerja Aseptik
Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya teknik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan. Mikroorganisme dapat juga ”jatuh” dari tangan operator, sarung tangan atau jas laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan teknik aseptik meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya teknik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan, namun semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang ditimbulkan (Pradhika 2009).
Teknik aseptis digunakan pada saat :
- Teknik aseptis seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dengan segala media pertumbuhannya.
- Teknik aseptis sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen.
- Teknik aseptis disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting.
- Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil yang didapatkan.
- Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi. Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri.
- Membuka dan merehidrasi bakteri terliofolisasi. Teknik aseptis dapat menjaga sel yang terrehidrasi dari bakteri kontaminan dan menjaga tidak keluarnya sel ke meja kerja.
- Melakukan reaksi restriksi atau PCR. Walaupun enzim restriksi pada umumnya disimpan dalam gliserol 50% (bakteriostatik) tapi enzim yang diencerkan akan lebih rentan rusak akibat aktivitas mikroorganisme atau dihambat oleh ion atau unsur tertentu. Kontaminasi DNA asing yang masuk ke dalam tube PCR mungkin dapat teramplifikasi sehingga hasil yang didapat membingungkan.
- Memberi label sel dengan fosfat. Pada kasus ini kerja aseptis ditujukan untuk melindungi operator dari bahan kimia berbahaya. Jika menggunakan teknik aseptis maka Anda tidak akan membiarkan tutup bahan radioaktif terbuka atau secara tidak sengaja menggunakan pipet bekas bahan radioaktif (Pradhika 2009).
Aturan umum teknik aseptis:
v Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety dapat menjaga dan mengatur aliran udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi.
v Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan. Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit dibersihkan pada sudut-sudut ruang.
v Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya. Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.
v Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan. Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll.)diperiksa terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek.
v Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler, pipet dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri, erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang lapang untuk bekerja.
v Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang menempel.
v Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang diperlukan beserta cadangannya.
v Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya.
v Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan.
v Minimalisasi gerak : pergerakan tangan dapat menciptakan aliran udara . semakin cepat pergerakannya semakin cepat aliran udara yang ditimbulkan. Pergerakan lengan sebaiknya dilakukan seperlu mungkin dan bergerak secara lembut.
v Minimalisasi jarak: jarak antar peralatan diatur seefektif dan seefisien mungikn, antar peralatan jangan diletakkan terlalu jauh.
v Minimalisasi keterpaparan : semakin sering menggerakkan sesuatu (mis: cawan berisi media) melewati udara maka semakin besar partikel udara untuk masuk. Semakin lama tutup erlenmeyer terbuka juga semakin besar terkontaminasi (Suhardin 2008).
Catatan penting dalam kerja aseptis :
v Tutup erlenmeyer, botol atau cawan sebaiknya dibuka kira-kira 450, tujuannya untuk meminimalisasi udara masuk namun masih dapat mentransfer sesuatu.
v Jika diharuskan untuk membuka penuh dan tutup diletakkan di meja kerja, maka tutup dapat diletakkan tertelungkup atau terlentang (muka menghadap ke atas). Jika tertelungkup pastikan permukaannya bersih dan bila terlentang pastikan juga tidak ada gerakan di atasnya.
v Untuk menghindari bakteri yang menempel pada jarum inokulum terpental/terciprat maka diameter loops harus berkisar 2-3 mm dan untuk memperkecil getaran panjang kawat tidak lebih dari 6cm.
v Tidak boleh menyedot cairan pada saat pipeting dengan mulut.
v Untuk menghindari penyebaran mikroba dari tetesan pipet yang terjatuh maka dapat digunakan kain steril yang diberi desinfektan sebagai alas. Kain ini setelah selesai dibuang sebagai limbah berbahaya (Suhardin 2008).
Daftar Pustaka:
Ardiansyah. 2004. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Bogor : Universitas Djuanda.
Fais,2009. Metode penanaman. [terhubung berkala] http://faizcute.blogspot.com. (2 September 2011).
Mulyana, dkk. 1992. Penuntun Praktikum Dasar-Dasar Mikrobiologi. Bogor : Universitas Djuanda.
Nurohaianah et al, 2007. Media . Jakarta : UI Press.
Pradhika Indra. 2009. [terhubung berkala] http://ekmon-saurus.blogspot.com/2009/05/bekerja-tanpa-kontaminasi-dasar-tehnik.html. (4 September 2011).
Suhardi, S.H., Koesnandar, D. K. Indriani, H. Arnaldo. 2008. Biosafety : Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. PT. Multazam Mitra Prima.Jakarta: PT.Multazam Mitra Prima.
Yanny Priantieni, E. 2004. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Bogor : SMAKBO.